PCR實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)備與要求(全文完整版)

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法

第一章  總則
第一條 為規(guī)范臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理，保證臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)質(zhì)量，使臨床診斷和治療更為科學(xué)、合理，特制定本辦法。
第二條 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)指以臨床診斷治療為目的，以擴(kuò)增檢測(cè)DNA或RNA為方法的檢測(cè)技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、連接酶鏈反應(yīng)（LCR）、轉(zhuǎn)錄依賴的放大系統(tǒng)（TAS）自主序列復(fù)制系統(tǒng)（3SR）和鏈替代擴(kuò)增（SDA）等。
第三條 本辦法適用于開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)立在二級(jí)以上醫(yī)院。
第四條 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須使用經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的臨床檢驗(yàn)試劑開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目。
第五條 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心（以下簡(jiǎn)稱衛(wèi)生部臨檢中心）和省、自治區(qū)、直轄市臨床檢驗(yàn)中心（以下簡(jiǎn)稱省臨檢中心）負(fù)責(zé)對(duì)所轄行政區(qū)域內(nèi)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量監(jiān)督管理工作。


第二章  實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和驗(yàn)收
第六條 擬設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)療機(jī)構(gòu)按照《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》（見附件）籌建實(shí)驗(yàn)室；籌建完成后，由法定代表人向衛(wèi)生部臨檢中心提出技術(shù)驗(yàn)收申請(qǐng)。申請(qǐng)時(shí)需提交以下材料：
（一）《醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證》復(fù)印件；
（二）可行性研究報(bào)告；
1、擬設(shè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室機(jī)構(gòu)的所在地醫(yī)療衛(wèi)生資源狀況、本機(jī)構(gòu)的基本情況、對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的需求以及臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行的預(yù)測(cè)分析；
2、擬設(shè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置平面圖；
3、擬設(shè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室將開展的檢驗(yàn)項(xiàng)目、實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件和有關(guān)技術(shù)人員資料
第七條 衛(wèi)生部臨檢中心和省臨檢中心共同組織相關(guān)專業(yè)的專家組（以下簡(jiǎn)稱專家組），按照《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)提出申請(qǐng)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)收。驗(yàn)收完成后，在20日內(nèi)將驗(yàn)收?qǐng)?bào)告寄送至申請(qǐng)機(jī)構(gòu)。
第八條 經(jīng)專家組技術(shù)驗(yàn)收合格的醫(yī)療機(jī)構(gòu)將本辦法第六條規(guī)定的材料及專家組驗(yàn)收?qǐng)?bào)告送至省級(jí)行政部備案。在將符合規(guī)定的全部材料送達(dá)省級(jí)衛(wèi)生行政部門后15日內(nèi)未收到省級(jí)衛(wèi)生行政部門不同意的意見，方可開展專家組技術(shù)驗(yàn)收合格的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目。
第九條 未經(jīng)專家組驗(yàn)收合格并報(bào)省級(jí)衛(wèi)生行政部門備案的醫(yī)療機(jī)構(gòu)不得擅自開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目。

第三章  實(shí)驗(yàn)室監(jiān)督管理
第十條 臨床基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須按照《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》（另發(fā)）開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作。
第十一條 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)。經(jīng)培訓(xùn)合格者，由培訓(xùn)單位發(fā)給合格證書，并將培訓(xùn)合格人員名單報(bào)衛(wèi)生部臨檢中心備案。獲得培訓(xùn)合格證書者方可從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作。
培訓(xùn)單位為衛(wèi)生部臨檢中心，或由省級(jí)衛(wèi)生行政部門指定并經(jīng)衛(wèi)生部臨檢中心認(rèn)定的機(jī)構(gòu)。培訓(xùn)時(shí)使用規(guī)定的統(tǒng)一教材。
第十二條 以科研為目的的基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目。不得向臨床出具檢驗(yàn)報(bào)告，不得向病人收取任何費(fèi)用。
第十三條 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須按照《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》開展室內(nèi)質(zhì)量控制，并參加衛(wèi)生部臨檢中心組織的室內(nèi)質(zhì)量評(píng)價(jià)。
第十四條 衛(wèi)生部臨檢中心按照本方法和《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》協(xié)調(diào)、組織省臨檢中心對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。監(jiān)測(cè)結(jié)果報(bào)省級(jí)衛(wèi)生行政部門，同時(shí)抄送被監(jiān)測(cè)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室所在醫(yī)療機(jī)構(gòu)。
第十五條 衛(wèi)生部臨檢中心或省級(jí)臨檢中心受省級(jí)以上衛(wèi)生行政部門委托可對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢查，現(xiàn)場(chǎng)檢查工作人員在履行職責(zé)時(shí)應(yīng)出示證件。在進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢查時(shí)，檢查人員有權(quán)調(diào)閱有關(guān)資料，被檢查機(jī)構(gòu)不得拒絕或隱瞞。
第十六條 衛(wèi)生部臨檢中心對(duì)在室間質(zhì)量評(píng)價(jià)中不合格的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室提出警告，對(duì)連續(xù)二次或三次中有二次發(fā)現(xiàn)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果不合格的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部臨檢中心報(bào)省級(jí)以上衛(wèi)生行政部門由省級(jí)以上衛(wèi)生行政部門責(zé)令其暫停有關(guān)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目，限期整改。經(jīng)專家組進(jìn)行再次技術(shù)驗(yàn)收并合格，并報(bào)省級(jí)衛(wèi)生行政部門核準(zhǔn)后，方可重新開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目。
第十七條 對(duì)于未經(jīng)衛(wèi)生部臨檢中心組織的專家組技術(shù)驗(yàn)收合格并報(bào)省級(jí)衛(wèi)生部門備案，擅自開展臨床基因檢驗(yàn)項(xiàng)目的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，由省級(jí)衛(wèi)生行政部門依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》第四十七條和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例實(shí)施細(xì)則》第八十條予以處罰，并予以公告。公告所需費(fèi)用由被公告機(jī)構(gòu)支付。
第十八條 出現(xiàn)下列情況之一的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，由省級(jí)衛(wèi)生行政部門責(zé)令其停止開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)，并對(duì)其所在醫(yī)療機(jī)構(gòu)予以公告。公告所需費(fèi)用由被公告機(jī)構(gòu)支付：
（一）開展超出衛(wèi)生部臨檢中心組織的技術(shù)驗(yàn)收合格并報(bào)省級(jí)衛(wèi)生行政部門備案臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的；
（二）使用未經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的試劑開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的；
（三）在臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)中未開展室內(nèi)質(zhì)量控制的；
（四）在臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)中未參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的；
（五）在臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)中弄虛作假的；
（六）以科研為目的的基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目向病人收取費(fèi)用的；
（七）使用未經(jīng)培訓(xùn)合格的專業(yè)技術(shù)人員從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的；


第四章  附則
第十九條 對(duì)采供血機(jī)構(gòu)的基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室開展基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的管理，參照本辦法執(zhí)行。
第二十條 衛(wèi)生部臨檢中心組織的專家組對(duì)申請(qǐng)開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)收所需費(fèi)用按國(guó)家有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。
第二十一條 本辦法由衛(wèi)生部負(fù)責(zé)解釋。
第二十二條 本辦法自發(fā)布之日起施行。
附：臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)
根據(jù)《臨床檢驗(yàn)擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》，制定本標(biāo)準(zhǔn)
一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則
（一）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則
1、試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)
2、標(biāo)本制備區(qū)
3、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)
4、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)
如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。
（二）各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。
（三）進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)―>標(biāo)本制備區(qū)―>擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)―>擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。
（四）不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。
二、工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)
（一）試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)
1、2-8C和-15C冰箱
2、混勻器
3、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）
4、移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）
5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）
6、專用工作服和工作鞋
7、專用辦公用品
（二）標(biāo)本制備區(qū)
1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱
2、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)
3、混允器
4、水浴箱或加熱模塊
5、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）
6、可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）
7、超凈工作臺(tái)
8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）
9、專用工作服和工作鞋
10、專用辦公用品
如需處理大分子DNA，應(yīng)具有超聲波水浴儀。
（三）擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)
1、核酸擴(kuò)增儀
2、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）
3、可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）
4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）
5、專用工作服和工作鞋
6、專用辦公用品
(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)
視檢驗(yàn)方法不同而定?；緝x器設(shè)備如下：
1、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）
2、可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）
3、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）
4、專用工作服和工作鞋
5、專用辦公用品

 

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范

為使基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)有效地應(yīng)用于臨床，更好地為疾病的預(yù)防、診斷和治療服務(wù)，保證檢驗(yàn)質(zhì)量，特制定本規(guī)范。

一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其管理

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置詳見《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)文)附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。為避免污染，必須嚴(yán)格遵循《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室四個(gè)隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)(簡(jiǎn)稱擴(kuò)增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。此外，當(dāng)工作者離開工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。

清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個(gè)主要原因，因此實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

(一)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

下述操作在該區(qū)進(jìn)行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。

貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過(guò)產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當(dāng)貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。

含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴(kuò)增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一次測(cè)定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來(lái)決定。

主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過(guò)預(yù)試驗(yàn)來(lái)檢查，評(píng)價(jià)結(jié)果必須有書面報(bào)告。對(duì)于"熱啟動(dòng)"技術(shù)(在第一個(gè)高溫變性步驟后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。

在整個(gè)本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施。

嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。

工作結(jié)束后必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。本工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對(duì)去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動(dòng)紫外燈(254nm波長(zhǎng))，在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上60~90cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對(duì)紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長(zhǎng)照射時(shí)間，最好是照射過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。

(二)標(biāo)本制備區(qū)

下述操作在該區(qū)進(jìn)行：臨床標(biāo)本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。

要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。可通過(guò)在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。

用過(guò)的加樣器吸頭必須放入專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室桌椅表面每次工作后都要清潔，實(shí)驗(yàn)材料(原始血標(biāo)本、血清標(biāo)本、提取中的標(biāo)本與試劑的混合液等)如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。

對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)適當(dāng)?shù)淖贤庹丈?254nm波長(zhǎng)，與工作臺(tái)面近距離)適合于滅活去污染。可移動(dòng)紫外線管燈可用來(lái)確保工作后對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面的充分照射。

樣本處理對(duì)核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標(biāo)本檢測(cè)前對(duì)提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成，因?yàn)閏DNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對(duì)容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置一個(gè)以上的溫育裝置。

cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的可能性降低。

待測(cè)RNA的cDNA拷貝須保存在標(biāo)本制備區(qū)，不得在本區(qū)對(duì)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(三)擴(kuò)增區(qū)

下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來(lái)自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

不能從本區(qū)再進(jìn)入任何"上游"區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。

為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。如有加樣則應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。打開預(yù)處理過(guò)的反應(yīng)混合液時(shí)必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴(kuò)增步驟之間。一個(gè)簡(jiǎn)單的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機(jī)，因其所占實(shí)驗(yàn)臺(tái)面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺(tái)。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過(guò)的加樣器必須注意清潔消毒。

完成操作及每天工作后都必須對(duì)實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。

(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測(cè)定。

核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測(cè)序方法等。目前國(guó)內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法。

本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此必須注意避免通過(guò)本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過(guò)的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。

由于本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負(fù)壓條件或減壓情況下(如安裝排風(fēng)扇)可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。

二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的所有階段，即測(cè)定分析前的標(biāo)本采集處理、測(cè)定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測(cè)定后的結(jié)果報(bào)告等。

(一)標(biāo)本的采集

常用于基因擴(kuò)增檢測(cè)的臨床標(biāo)本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時(shí)，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來(lái)自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時(shí)必須戴一次性手套。
玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因?yàn)椴Ａ髅蟪：胁灰资Щ畹腞NA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。

全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因?yàn)楦嗡厥荰aq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。參考潔凈室http://www.iwuchen.com/

臨床用于RNA(如HCV RNA)擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快(3小時(shí)以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清。

(二)標(biāo)本的穩(wěn)定化處理

用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。

由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測(cè)定的標(biāo)本有時(shí)必須進(jìn)行穩(wěn)定化處理，如流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場(chǎng)采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。對(duì)于特定的檢測(cè)項(xiàng)目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定方法來(lái)評(píng)價(jià)。

(三)標(biāo)本的運(yùn)送

標(biāo)本采集后必須盡快送至實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)過(guò)適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過(guò)郵寄運(yùn)送。如用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的EDTA抗凝全血標(biāo)本及用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。通常在運(yùn)送時(shí)，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。用于RNA檢測(cè)的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。

(四)標(biāo)本的貯存

臨床體液標(biāo)本如血清/血漿等可于-70℃下長(zhǎng)時(shí)間貯存。用于DNA測(cè)定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。用于RNA測(cè)定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天。

(五)標(biāo)本的處理(核酸提取)

標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測(cè)成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行充分評(píng)價(jià)以驗(yàn)證其提取的有效性。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來(lái)源于標(biāo)本本身(如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物)或核酸提取過(guò)程中殘留的有機(jī)溶劑(如酚、氯仿等)，這些物質(zhì)對(duì)其后的Taq酶擴(kuò)增反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測(cè)定。當(dāng)標(biāo)本為痰時(shí)，則必須先進(jìn)行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。此外，當(dāng)靶核酸為RNA時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定失敗的常見原因是標(biāo)本在運(yùn)送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對(duì)于前者，要核查測(cè)定分析前的步驟，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒絕接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對(duì)運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。對(duì)于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。

(六)靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和擴(kuò)增

1、靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄

cDNA合成為逆轉(zhuǎn)錄PCR中的第一個(gè)酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的cDNA為靶RNA的反向互補(bǔ)鏈，為后面擴(kuò)增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：(1)逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯(cuò)誤等；(2)用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)；(3)RNA酶的存在導(dǎo)致RNA的降解。

2、核酸的擴(kuò)增

有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測(cè)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對(duì)、Mg 濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須定期對(duì)擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以避免假陰性結(jié)果。

(七)污染

在實(shí)際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴(kuò)增片段的污染(產(chǎn)物污染)；天然基因組DNA的污染、試劑污染(貯存液或工作液)以及標(biāo)本間交叉污染(如氣溶膠從一個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本)。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中污染的最主要來(lái)源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。

由于一旦發(fā)生污染后，再圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不僅耗時(shí)而且還很繁瑣，所以防止污染重在預(yù)防。但如果發(fā)生了污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢。

1、測(cè)定分析前的污染源

測(cè)定分析前實(shí)驗(yàn)材料的污染主要來(lái)自非病人標(biāo)本來(lái)源的核酸。

2、測(cè)定分析階段的污染源

通常，測(cè)定分析階段的每一步都可能發(fā)生對(duì)樣本的污染。反應(yīng)混合液的任何成分及核酸的制備和反應(yīng)建立階段所涉及到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反應(yīng)管，吸頭)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備(如加樣器、離心機(jī))等。

在前面三個(gè)工作區(qū)中，不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作會(huì)引起所使用的試劑、消耗品或?qū)嶒?yàn)設(shè)備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測(cè)時(shí)，非常容易引起污染，因此必須制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，并嚴(yán)格執(zhí)行。

3、污染的避免

要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防而不是排除污染，前面所述對(duì)工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的即是為了預(yù)防污染。

為避免以前測(cè)定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。如在擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP，使得產(chǎn)生的特異擴(kuò)增片段含有尿嘧啶，這樣擴(kuò)增前在反應(yīng)混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)，可破壞來(lái)自以前測(cè)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免其對(duì)以后要進(jìn)行的擴(kuò)增測(cè)定的污染。另外一種方法是持續(xù)的長(zhǎng)波紫外燈照射，通過(guò)異補(bǔ)骨脂素光化學(xué)產(chǎn)生DNA加合物，由于DNA加合物對(duì)擴(kuò)增沒(méi)有反應(yīng)但又不妨礙PCR后雜交過(guò)程，所以這種方法也能防止污染。

上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其來(lái)替代嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和管理，尤其是這些方法不能防止外來(lái)非擴(kuò)增的天然DNA的污染。

4、去除污染的措施

工作完后必須定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同的方法可達(dá)到最佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種：(1)用10%(v/v)次氯酸鈉清潔表面；(2)試驗(yàn)后長(zhǎng)時(shí)間的紫外照射實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)面和其他表面；(3)實(shí)驗(yàn)設(shè)備如加樣器的高壓消毒。

(八)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測(cè)序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗(yàn)項(xiàng)目基本上都使用探針雜交方法。

雜交結(jié)果不充分的原因可能是基因探針不合適、標(biāo)記方法不對(duì)、對(duì)探針的標(biāo)記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。

最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉(zhuǎn)錄的反義RNA探針。探針的標(biāo)記物常用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。

在擴(kuò)增后的雜交檢測(cè)中,應(yīng)該嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強(qiáng)度太高都會(huì)降低雜交的嚴(yán)格性，還會(huì)給檢測(cè)信號(hào)的特異性帶來(lái)負(fù)面影響。相反，提高溫度和/或降低離子強(qiáng)度會(huì)增加雜交的嚴(yán)格性。因此，嚴(yán)密控制溫度和試劑的離子強(qiáng)度是避免假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的先決條件。要注意的是，溫度和離子強(qiáng)度不能同時(shí)改變。

(九)質(zhì)量控制

質(zhì)量控制包括兩個(gè)方面，即室內(nèi)質(zhì)量控制(以下簡(jiǎn)稱質(zhì)控)和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1、室內(nèi)質(zhì)量控制

必須對(duì)DNA和RNA分析的各步進(jìn)行質(zhì)量控制，以避免假陽(yáng)性和假陰性，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。由于核酸擴(kuò)增測(cè)定的高敏感性，所以標(biāo)本制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增本身和產(chǎn)物分析中的每一步都要求有質(zhì)控措施。

(1)標(biāo)本制備：

常用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNA提取效果，以判斷所提取的DNA是否發(fā)生降解。用常規(guī)的手工提取方法制備的DNA的平均長(zhǎng)度一般為~100kb，用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長(zhǎng)度平均范圍為30-40kb。明顯出現(xiàn)降解的DNA(在1和10kb的低分子量范圍內(nèi))在經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強(qiáng)的熒光信號(hào)。用對(duì)甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶(如EcoRI)消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M(jìn)行質(zhì)控(在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切)。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測(cè)定來(lái)估計(jì)，質(zhì)量好的DNA提取物，A260/A280比值應(yīng)該在1.75~2.0之間;否則,殘留的蛋白或酚可能會(huì)很高。僅用光度計(jì)比色方法不能對(duì)DNA的完整性下結(jié)論。

最快的對(duì)總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳,這一點(diǎn)跟DNA分離相同。但如果對(duì)結(jié)果有疑問(wèn),就應(yīng)該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)RNA的完整性。在理想情況下,三種主要的核糖體RNA(28S、18S和5S)在凝膠上出現(xiàn)的帶相對(duì)較窄。如發(fā)生RNA的降解，則出現(xiàn)大量低分子量帶或出現(xiàn)帶的消失。測(cè)定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對(duì)RNA制備的質(zhì)量評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)向低分子量拖尾的、不對(duì)稱性的峰的評(píng)估也是RNA完整性的合適的指標(biāo)。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨(dú)的光度計(jì)比色方法也不能對(duì)RNA的完整性下結(jié)論。

對(duì)于血清（漿）中病毒的測(cè)定，則要評(píng)價(jià)標(biāo)本出現(xiàn)溶血、脂血和黃膽情況下標(biāo)本處理方法對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)的影響，避免由于標(biāo)本處理方法的不當(dāng)而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，還可采用已知濃度標(biāo)本評(píng)價(jià)核酸提取方法的效果。

(2)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增：本部份包括陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。

對(duì)逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增的質(zhì)控既可使用內(nèi)標(biāo)質(zhì)控方法也可采用外標(biāo)質(zhì)控方法。逆轉(zhuǎn)錄-擴(kuò)增檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)通常為在整個(gè)細(xì)胞周期中均勻表達(dá)的mRNA，如HLA、β肌動(dòng)蛋白和組蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。此外，也可在標(biāo)本制備時(shí)將外來(lái)內(nèi)標(biāo)加入到樣本中共同提取、逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。當(dāng)標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制物，或核酸提取中發(fā)生RNA降解，或逆轉(zhuǎn)錄酶失活，內(nèi)標(biāo)即會(huì)表現(xiàn)為陰性結(jié)果。
對(duì)于DNA測(cè)定內(nèi)標(biāo)可使用對(duì)有機(jī)體存活所必須的靶基因，如維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因。對(duì)于病原體的基因檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)多采用人工制備的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)可以監(jiān)控每一擴(kuò)增孔中假陰性的產(chǎn)生情況。

目前的商品試劑盒大部分沒(méi)采用內(nèi)標(biāo)方法質(zhì)控。因此在測(cè)定血清/血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時(shí)，應(yīng)使用已知的弱陽(yáng)性血清/血漿作為質(zhì)控樣本，與待測(cè)臨床標(biāo)本等同處理提取核酸及擴(kuò)增，以判斷逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增檢測(cè)的效果。

使用這些外加弱陽(yáng)性質(zhì)控不但可檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR試劑的檢測(cè)下限和特異性的信息。這些質(zhì)控樣本在擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)必須使用與患者的標(biāo)本相同的主反應(yīng)混合液。

每一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)中都必須設(shè)有外加陰性質(zhì)控(污染監(jiān)測(cè)質(zhì)控)，為判斷擴(kuò)增過(guò)程中污染出現(xiàn)的階段，陰性質(zhì)控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個(gè)過(guò)程中所帶的空白管、僅有擴(kuò)增反應(yīng)液但不含擴(kuò)增模板的反應(yīng)管、陰性標(biāo)本等。陰性標(biāo)本可以評(píng)估PCR實(shí)驗(yàn)的綜合質(zhì)量。

在擴(kuò)增靶RNA的RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，可做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過(guò)這種方法，可發(fā)現(xiàn)以前擴(kuò)增的DNA片段所引起的污染。

(3)板上雜交和膜上斑點(diǎn)印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點(diǎn)雜交時(shí)，陽(yáng)性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標(biāo)本平行進(jìn)行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對(duì)結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。

(4)測(cè)定結(jié)果的評(píng)價(jià)與報(bào)告：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，在判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)先對(duì)擴(kuò)增的熒光信號(hào)作出定性判斷，然后再進(jìn)行定量分析，避免一些非特異熒光信號(hào)對(duì)結(jié)果分析的干擾。

結(jié)果的報(bào)告必須簡(jiǎn)單清楚。定性測(cè)定報(bào)告"陽(yáng)性"或"陰性"即可。定量測(cè)定則必須報(bào)告量的多少，如結(jié)果高于測(cè)定方法線性范圍上限，則對(duì)樣本稀釋后再測(cè)，結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)；如結(jié)果低于方法的測(cè)定范圍下限，則報(bào)?lt;多少即可，不能報(bào)告為"0"或"陰性"。

2、室間質(zhì)量評(píng)價(jià)

所有開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室都必須參加由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的全國(guó)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果將作為其開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的依據(jù)之一。

本工作規(guī)范自公布之日起實(shí)施。

 

如何迎接臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收

   臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室主要應(yīng)用把PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)應(yīng)用于疾病的診斷與治療監(jiān)測(cè)。PCR技術(shù)發(fā)明是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉，具有深遠(yuǎn)歷史意義，但在上世紀(jì)九十年代中國(guó)，在我國(guó)由于部分醫(yī)部機(jī)構(gòu)受利益的驅(qū)動(dòng)，在缺乏技術(shù)、設(shè)備以及規(guī)范化管理的情況下，PCR技術(shù)臨床應(yīng)用泛濫，出現(xiàn)大量假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，甚至出現(xiàn)虛假檢測(cè)報(bào)告，造成檢驗(yàn)結(jié)果和臨床意義應(yīng)用十分混亂，嚴(yán)重?cái)_亂正常醫(yī)療秩序，特別在性病基因檢測(cè)方面，甚至還帶來(lái)一系列道德倫理、家庭糾紛以及社會(huì)和法律問(wèn)題。PCR技術(shù)臨床應(yīng)用所出現(xiàn)的一系列問(wèn)題引起衛(wèi)生部管理層高度重視，衛(wèi)生部醫(yī)政司于1988年下發(fā)了衛(wèi)醫(yī)發(fā)[1998]9號(hào)文件宣布PCR技術(shù)暫停應(yīng)用于臨床診斷。經(jīng)過(guò)近四年反復(fù)論證，衛(wèi)生部2002年1月14日發(fā)布“臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法”，同年2月20日衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心發(fā)布“臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范”。兩個(gè)文件宣布了PCR技術(shù)臨床應(yīng)用解凍，明確規(guī)定臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室開展PCR技術(shù)必需具備的基本條件：①規(guī)范的PCR實(shí)驗(yàn)室②編寫適合本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量手冊(cè)③經(jīng)PCR專業(yè)知識(shí)培訓(xùn)的技術(shù)人員（PCR上崗證）④使用有生產(chǎn)批文的PCR試劑。具備條件的二級(jí)以上醫(yī)院可向衛(wèi)生部或省臨床檢驗(yàn)中心申請(qǐng)技術(shù)驗(yàn)收。

   本人作為通過(guò)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心驗(yàn)收的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室一名實(shí)驗(yàn)室工作人員，同時(shí)也作為專家多次參與衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收，就臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收的前期準(zhǔn)備工作和現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)驗(yàn)收整個(gè)過(guò)程作一簡(jiǎn)單介紹，并談?wù)劚救梭w會(huì)。
一、為什么要進(jìn)行臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)增收
   臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室采用PCR技術(shù)用于臨床基因診斷，由于PCR技術(shù)對(duì)所檢測(cè)的核酸模板進(jìn)行大量擴(kuò)增，容易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室污染導(dǎo)致臨床檢測(cè)標(biāo)本假陽(yáng)性結(jié)果；另外由于PCR技術(shù)要求高、影響因素多（特別是RNA標(biāo)本），實(shí)驗(yàn)過(guò)程處理不當(dāng)易導(dǎo)致核酸模板無(wú)擴(kuò)增現(xiàn)象，導(dǎo)致臨床標(biāo)本假陰性結(jié)果。因此臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收和規(guī)范化管理是PCR技術(shù)本身需要，也是在臨床上順利應(yīng)用該技術(shù)前提。
二、PCR實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收準(zhǔn)備工作
（一）硬件準(zhǔn)備――實(shí)驗(yàn)室基本建設(shè)
1.根據(jù)文件要求，臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)；擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。
2.各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。
3.進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一流向進(jìn)行，即試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。
4.不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。
5.工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)
（1）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)
    2～8℃和-15℃冰箱：混勻器；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。
（2）標(biāo)本制備區(qū)
    2～8℃冰箱，-20℃或-80℃冰箱；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）；超凈工作臺(tái)，消耗品；一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。
（3）擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)
   核酸擴(kuò)增儀；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。
（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)
   視檢測(cè)方法不同而定。基本儀器設(shè)備如下：微量加樣器（覆蓋1～200μl）；可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。
（二）軟件建設(shè)――質(zhì)量手冊(cè)編寫與實(shí)施、人才資源（上崗證培訓(xùn)與相關(guān)知識(shí)學(xué)習(xí)）
1.臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量手冊(cè)編寫
   質(zhì)量手冊(cè)是闡明臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量方針，并描述過(guò)其質(zhì)量體系的文件。質(zhì)量手冊(cè)規(guī)定了質(zhì)量體系的基本結(jié)構(gòu)，是實(shí)施和保持質(zhì)量體系應(yīng)長(zhǎng)期遵循的文件。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量手冊(cè)編寫應(yīng)依照衛(wèi)生部下發(fā)兩個(gè)文件，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況編寫適合本實(shí)驗(yàn)室的切實(shí)可行的質(zhì)量手冊(cè)。質(zhì)量手冊(cè)的提綱應(yīng)包括三部分：質(zhì)量方針和宗旨；工作制度；標(biāo)準(zhǔn)操作文件（SOP）
（1）質(zhì)量方針和宗旨
   制定臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理目標(biāo)和質(zhì)量保證體系的結(jié)構(gòu)體系和總方針。
（2）工作制度
   一般應(yīng)包括以下文件：實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置、布局及組織結(jié)構(gòu)；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)務(wù)管理制度；實(shí)驗(yàn)室的人員配置及管理制度；生物的防護(hù)與安全制度；實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理制度；實(shí)驗(yàn)室清潔消毒制度；儀器設(shè)備的管理制度；儀器、試劑、耗材購(gòu)置程序及管理制度；臨床標(biāo)本的管理制度；實(shí)驗(yàn)室記錄的管理制度；質(zhì)量控制工作管理制度；結(jié)果報(bào)告管理制度；抱怨的內(nèi)部處理制度；負(fù)責(zé)人及質(zhì)檢員職責(zé)；崗位設(shè)置和責(zé)任制等……
（3）標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）
   一般包括：消毒液配制標(biāo)準(zhǔn)操作程序：消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序；超凈工作臺(tái)使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；超凈工作臺(tái)維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作文件；PCR儀使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；PCR儀維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；高速低溫離心機(jī)使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；移液器使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；冰箱維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；電熱恒溫水浴箱操作程序；電子天平使用和校正操作程序；可移動(dòng)紫外消毒車使用操作程序；加樣器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；離心機(jī)維護(hù)保養(yǎng)操作程序；溫度計(jì)校準(zhǔn)程序；試劑的質(zhì)檢操作程序；標(biāo)本唯一標(biāo)識(shí)編號(hào)編制規(guī)則；臨床標(biāo)本的采集及處理操作程序；臨床標(biāo)本的保存程序；乙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；丙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；沙眼衣原體核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序等……
（4）引用圖表：PCR擴(kuò)增可接受標(biāo)本記錄表；PCR擴(kuò)增拒收標(biāo)本記錄表；室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果記錄表；室間質(zhì)控記錄表；消耗性材料驗(yàn)收記錄表；試劑驗(yàn)收記錄表；故障處理表；臺(tái)階式高速離心機(jī)使用記錄表；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)使用記錄表；擴(kuò)增儀維護(hù)保養(yǎng)記錄表；人員培訓(xùn)計(jì)劃及培訓(xùn)記錄表；實(shí)驗(yàn)室工作人員一覽表；主要設(shè)備一覽表；實(shí)驗(yàn)室清潔消毒記錄表；工作區(qū)溫度、濕度記錄表；抱怨記錄表；標(biāo)本超低溫保存記錄表；應(yīng)急處理記錄表；垃圾處理記錄表；冰箱溫度記錄表；水浴箱溫度記錄表；移動(dòng)紫外消毒車記錄表；設(shè)備校正記錄表；檢測(cè)結(jié)果報(bào)告流程；報(bào)告單樣張；臨床送檢標(biāo)本流程圖；實(shí)驗(yàn)室組織結(jié)構(gòu)圖。
三、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收申請(qǐng)
（1）填寫臨床擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收申請(qǐng)表
（a）基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本情況
   包括檢驗(yàn)科基本情況特別是基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本運(yùn)行情況，必要性與可行性，著重分析開展項(xiàng)目運(yùn)行情況、人員配置現(xiàn)狀、內(nèi)部質(zhì)量管理體系執(zhí)行情況與效果分析。
（b）應(yīng)提供資料
醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證；
   擬設(shè)置基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室醫(yī)院的醫(yī)療衛(wèi)生資源狀況、對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的需求情況以及實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行的預(yù)測(cè)分析；
   擬設(shè)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置平面圖；
   實(shí)驗(yàn)室主要負(fù)責(zé)人簡(jiǎn)歷表；
   實(shí)驗(yàn)室工作人員一覽表（附實(shí)驗(yàn)室工作人員簡(jiǎn)歷）；
   主要儀器設(shè)備表；
   擬開展的臨床基因診斷項(xiàng)目；
   臨床基因診斷質(zhì)量手冊(cè)；
   檢驗(yàn)報(bào)告單2份。
（c）希望驗(yàn)收時(shí)間
   根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建設(shè)進(jìn)展情況和試運(yùn)行進(jìn)展，提出大致的現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)驗(yàn)收時(shí)間。
（d）聲明
   志愿申請(qǐng)，承擔(dān)兩義務(wù)：遵守《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》和《臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》及有關(guān)規(guī)定；不論能否獲準(zhǔn)通過(guò)驗(yàn)收，預(yù)付驗(yàn)收階段的全部費(fèi)用。
（2）衛(wèi)生部或省臨床檢驗(yàn)中心預(yù)審
   對(duì)申報(bào)文件和現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行預(yù)驗(yàn)收，初步確定是否進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)收和驗(yàn)收時(shí)間。
四、現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)驗(yàn)收
衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)任務(wù)書現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)專家組成員組成
技術(shù)驗(yàn)收工作日程表
驗(yàn)收組預(yù)備會(huì)
首次會(huì)議
現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)收
實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備配備情況
實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序文件
有關(guān)記錄
現(xiàn)場(chǎng)考核
現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)
驗(yàn)收組全體會(huì)議
擬定驗(yàn)收結(jié)論和驗(yàn)收?qǐng)?bào)告
末次會(huì)議
驗(yàn)收組宣布驗(yàn)收結(jié)論
實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人講話
５.臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收體會(huì)
（１）對(duì)驗(yàn)收文件的學(xué)習(xí)不夠、理解不深，導(dǎo)致編制程序性文件偏離，應(yīng)對(duì)照驗(yàn)收要求逐條落實(shí)，切實(shí)可行。
（２）目的性認(rèn)識(shí)不足：
   受老觀念的影響，總以為實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收準(zhǔn)備工作是為專家而準(zhǔn)備的，沒(méi)意識(shí)到這是本實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)質(zhì)量的內(nèi)在需要，以為只要通過(guò)專家現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)收，拿到合格證書就萬(wàn)事大吉了。
（３）質(zhì)量控制意識(shí)不強(qiáng)
   我們編寫的質(zhì)量手冊(cè)的目的是規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作整個(gè)過(guò)程，做到實(shí)驗(yàn)過(guò)程有章可循，實(shí)驗(yàn)記錄有據(jù)可查，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。由于基因擴(kuò)增技術(shù)特殊性，即使嚴(yán)格按質(zhì)量手冊(cè)進(jìn)行操作，也難免出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果，因此還應(yīng)該強(qiáng)化質(zhì)量控制意識(shí)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格設(shè)置質(zhì)控標(biāo)本，包括試劑空白對(duì)照、陰性標(biāo)本對(duì)照、臨界值陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照等，分別監(jiān)測(cè)試劑配制與加樣過(guò)程中是否存在污染？標(biāo)本核酸模板提取過(guò)程中是否存在污染？標(biāo)本檢測(cè)過(guò)程中是否存在假陰性結(jié)果和結(jié)果是否準(zhǔn)確？等。但有些醫(yī)院由于考慮到各種實(shí)際問(wèn)題而沒(méi)有很好落實(shí)，應(yīng)引起高度重視。
（4）程序文件實(shí)施難問(wèn)題
   在許多醫(yī)院，由于基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室是目前大多檢驗(yàn)科唯一通過(guò)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收的實(shí)驗(yàn)室，可能受周邊其他實(shí)驗(yàn)室不規(guī)范行為的干擾和存在人員配備方面問(wèn)題，可能出現(xiàn)文件落實(shí)方面問(wèn)題，特別是原始標(biāo)本的接收和記錄方面。
（5）工作量少影響質(zhì)量保證體系實(shí)施
   嚴(yán)格按臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求通過(guò)驗(yàn)收的實(shí)驗(yàn)室，存在一定運(yùn)行成本，需要有一定臨床標(biāo)本量的支持；如果某一醫(yī)院醫(yī)療資源不足，標(biāo)本來(lái)源不足以支持運(yùn)行成本時(shí)，就會(huì)想方設(shè)法去減少運(yùn)行成本（包括試劑成本和勞務(wù)成本），導(dǎo)致檢驗(yàn)質(zhì)量難以得到保證。因此建議欲建立臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的單位，應(yīng)充分考慮自己醫(yī)療資源情況，確定是自己建立臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室合算？還是外送標(biāo)本合算？。同時(shí)衛(wèi)生部和省臨床檢驗(yàn)中心在初審應(yīng)充分考慮這方面情況，以及現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)收專家應(yīng)嚴(yán)加把關(guān)。